2025年3月16日頒布的GB 4789.38－2025《食品安全國家標準　食品微生物學檢驗　大腸埃希氏菌計數(shù)》將于9月16日正式實施。新標準對范圍、檢驗原理、設備和材料、培養(yǎng)基和試劑、檢驗程序、操作步驟、結果與報告多個方面都進行了規(guī)定。由于文本內容較多，我們不再一一贅述?，F(xiàn)將其重大變化總結如下：

重大變化1：MPN法中增加了貝類及產(chǎn)品的接種方法以及MPN表

由于牡蠣等雙殼貝類本身產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶，所以更適用于MPN法進行檢測。在國際標準ISO 16649.3-2015以及FDA BAM中對雙殼貝類產(chǎn)品均采用每個稀釋度接種5管，接種3個連續(xù)稀釋度共15管的方法。為了滿足出口需要，新標準中增加了5管接種方法，還將需要采用5管接種的范圍擴大為全部貝類及產(chǎn)品。

重大變化2：MPN法中TBX瓊脂取代了EMB及后續(xù)的生化試驗

從MPN法流程來看，簡化了操作步驟不再進行生化確認，意味著大大縮短了檢測時間?？赡艽蠹視幸蓡枺喝∠b定會不會影響結果的準確性呢？我們從兩方面進行解答：

1）EMB本身為弱選擇性培養(yǎng)基，特異性較差。再加上后續(xù)的生化實驗，操作步驟比較繁瑣。

2）TBX是利用大腸埃希氏菌所產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶，與培養(yǎng)基中顯色底物反應，使菌落著色來區(qū)分大腸埃希氏菌和其他非目標菌。

標準制修訂專家在標準宣貫時也提到TBX的特異性遠遠高于EMB，同時β-葡萄糖醛酸苷酶的準確度也明顯高于生化鑒定IMViC。

重大變化3：平板計數(shù)法中TBX瓊脂取代了VRBA和VRBA-MUG

如果說MPN法中TBX瓊脂的引入提高了時效，那么平板計數(shù)法又為何用TBX瓊脂來取代同樣無需生化確認的VRBA-MUG呢？我們要從VRBA-MUG的反應原理說起，VRBA-MUG同樣是利用大腸埃希氏菌所產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶，不同的是培養(yǎng)基中的底物為4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷（MUG）。大腸埃希氏菌能夠分解培養(yǎng)基中的MUG，使4-甲基傘形酮游離出來，在長波紫外光下產(chǎn)生藍色熒光。因為菌落計數(shù)依賴于熒光的觀察，所以實際操作時可能會遇到一些問題。

1）紫外燈：觀察熒光需要合適的紫外燈，不同紫外燈下觀察到的熒光有明顯差異。所以配置時需要關注波長、功率等。

兩臺不同紫外燈觀察到的熒光強弱有差異

2）計數(shù)：4-甲基傘形酮具有水溶性，即使在標準規(guī)定的適宜菌落數(shù)的平板上，熒光擴散很容易將非目標菌也染上熒光，造成計數(shù)困難。

    不同目標菌數(shù)量時顯現(xiàn)的熒光情況

3）假陰性：2012版標準接種方式為先傾注VRBA再覆蓋VRBA-MUG，不能直接接觸到VRBA-MUG的目標菌熒光不明顯，可能導致假陰性。

4）試驗器皿的干擾：要求材質良好且潔凈無殘留。因為某些器皿材質本身含有熒光物質，或者清洗時殘留的洗滌劑也可能會有熒光，容易造成假陽性結果。

5）標準菌株對照：操作時要求使用陽性目標菌和陰性菌作為對照，以保證結果的有效性。

綜上所述，VRBA-MUG在實際應用中存在諸多難點，而TBX瓊脂具有良好的特異性，單純從菌落顏色來進行判定，不僅無需配置特定設備，而且觀察簡單明了，也減少了判讀誤差。

TBX瓊脂是胰蛋白胨膽鹽 X-葡萄糖醛酸苷（TBX）瓊脂的簡稱，原理是利用大腸埃希氏菌所產(chǎn)生特異性的β-葡萄糖醛酸苷酶，分解TBX瓊脂中的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷底物，形成藍綠色菌落，從而區(qū)分目標菌和其他菌。

--注：絕大多數(shù)大腸埃希氏菌具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。但大腸埃希氏菌 O157等菌株沒有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。另外，腸桿菌科內一些志賀氏菌、沙門氏菌等菌株也具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。

接著看看分別用標準菌株驗證目標菌回收率、非目標菌特異性及選擇性，以及使用樣品添加、質控樣品及自然污染樣品驗證其實際應用的結果。

1）標準菌株試驗：不同菌株生長情況如表1所示。

--大腸埃希氏菌在TBX瓊脂上菌落形態(tài)為藍綠色且菌落中心顏色深，回收率PR均大于0.7（質控依據(jù)參照VRBA瓊脂）；

--大腸埃希氏菌O157由于不產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶，則表現(xiàn)為無色菌落；

--多數(shù)非大腸埃希氏菌的腸桿菌科細菌呈現(xiàn)無色菌落；

--銅綠假單胞菌由于可產(chǎn)生藍綠色素，呈現(xiàn)綠色擴散菌落，可以與大腸埃希氏菌進行區(qū)分；

--沙門氏菌中亞利桑那沙門因具有β-葡萄糖醛酸苷酶的活性會引起誤判，但沙門作為致病菌更應該被監(jiān)測，所以也算是誤打誤撞可以一網(wǎng)打盡；

--枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特氏菌等革蘭氏陽性菌株在TBX瓊脂上被完全抑制。

表1：不同標準菌株在TBX瓊脂上生長情況

2）模擬實際應用：

      將TBX瓊脂應用于樣品（含陽性添加）及質控樣品的檢測，使用平板計數(shù)法進行試驗，大腸埃希氏菌均呈現(xiàn)出鮮明的藍綠色，與非目標菌容易區(qū)分，觀察計數(shù)非常輕松。而高污染背景的下水道涂抹（直接劃線）和廁所水樣品（平板計數(shù)法）用TBX瓊脂檢測時，也能呈現(xiàn)出很好的選擇性。

        因此，TBX瓊脂無論是標準菌株試驗還是模擬實際應用，不僅操作簡單、計數(shù)簡便，其生長率、特異性和選擇性都呈現(xiàn)很好的效果。