2.靛基質、尿素酶和氰化鉀生長試驗

如果初步判斷符合可疑沙門氏菌屬的生化結果時，挑取純化好的可疑菌落，再繼續(xù)做靛基質、尿素酶和氰化鉀生長試驗，這三步試驗也可與三糖鐵瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗同時做，36℃±1℃培養(yǎng)16h-24h，必要時可延長培養(yǎng)至48h，純化后的營養(yǎng)瓊脂平板儲存于2℃-5℃或室溫至少保留24h，以便進行后續(xù)的生化試驗和必要時復查。

2.1靛基質試驗

將純化后的可疑菌株接種至蛋白胨水中，36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h，培養(yǎng)后沿管壁緩慢的加入柯凡克試劑或歐-波試劑，若此可疑菌株可分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚與靛基質試劑中的對二甲氨基苯甲醛反應生成紅色的玫瑰吲哚，為陽性；若不分解色氨酸則仍是黃色，為陰性。

2.2尿素酶試驗

某些細菌產生的尿素酶分解尿素可產生大量的堿性物質-氨，使培養(yǎng)基pH值升高，指示劑酚紅變成紅色，為陽性；

在試驗操作時，應待滅菌后的尿素瓊脂基礎冷卻至55℃時，再每95mL基礎中加入5mL 40%尿素水，防止基礎溫度過高使尿素水分解，充分混勻后分裝試管，制成斜面。

2.3氰化鉀試驗

該試驗的目的是為了鑒別細菌能否被一定濃度的氰化鉀抑制而導致細菌不生長；若試驗管生長渾濁為陽性，不生長且澄清的為陰性。

注意??在進行試驗操作時，應將同一株可疑菌同時接種氰化鉀對照管和試驗管各一支；

氰化鉀試驗操作時易失敗的主要原因：

????在氰化鉀對照管和試驗管接種可疑菌株后，應使用無菌的液體石蠟覆蓋液面，若不覆蓋，氰化鉀會逐漸分解，產生氫氰酸氣體逸出，以致氰化鉀濃度降低，細菌生長，造成假陽性的結果。

氰化鉀為劇毒物質，可抑制呼吸酶，造成細胞內窒息，吸入、口服或經皮膚吸收均可引起急性中毒，在操作該試驗時應做好個人防護，避免接觸、入口或吸入。

廢棄處理???試驗結果觀察結束后，在每管中加入0.5mL的40%氫氧化鉀溶液和數粒硫酸亞鐵，反應數小時后，建議121℃高壓滅菌30min，廢棄。

2.4生化結果鑒定

根據以上的試驗結果，查詢表3對沙門氏菌屬進行初步鑒定：

反應序號A1：

當試驗結果符合A1時，為沙門氏菌屬的典型反應，生化結果可初步判定為沙門氏菌；

若此表格中，有1項不符合時，再參考表4中的“判定結果”再進行血清或生化的驗證試驗；

若有2項結果不符合時，判定為非沙門氏菌。

表4判定結果解讀：

• 若試驗結果為第1種情況時，生化結果初步鑒定為甲型副傷寒沙門氏菌，需通過查詢WKLM抗原表，確定甲型副傷寒沙門氏菌的O抗原和H抗原的因子，再進行血清學的驗證試驗。

• 若試驗結果為第2種情況時，生化結果初步鑒定為沙門氏菌IV或V，若需分清是IV還是V，就需要按照表5做相應的生化試驗再進行分群，最終的鑒定還需要參考血清學鑒定的結果共同確定。

• 若試驗結果為第3種情況時，生化結果初步鑒定為沙門氏菌個別變體，需要再做血清學鑒定試驗。

反應序號A2：

?當試驗結果符合A2時，需要再做甘露醇和山梨醇兩項試驗，若補做的甘露醇和山梨醇均為陽性結果時，繼續(xù)做血清學鑒定試驗，結合血清學的試驗結果進行判定；

反應序號A3：

當試驗結果符合A3時，需補做ONPG試驗；

若賴氨酸脫羧酶為陽性，ONPG為陰性時生化結果初步判定為沙門氏菌；

若賴氨酸脫羧酶和ONPG的結果均為陰性時，生化結果初步判定為甲型副傷寒沙門氏菌。

以上部分為單獨做每項生化的操作和結果判讀，但是操作較繁瑣易出錯，建議使用DBI-05沙門氏菌的生化鑒定試劑盒操作，參考說明書，流程簡單幾步完成，結果易觀察，減少出錯率。

具體操作如下：

操作時的注意事項

1. 1.??????DBI沙門氏菌生化鑒定試劑盒操作用的菌株，應使用純化培養(yǎng)18-24h的新鮮菌株；

2. 2.??????一定要在試劑盒的長凹槽中加無菌水或無菌生理鹽水，防止培養(yǎng)過程中菌懸液干燥，影響結果觀察；

3. 3.??????調整0.5麥氏濁度菌懸液時，應少量多次的加菌，同時與標準0.5麥氏濁度比濁管對光比較；標準0.5麥氏濁度比濁管一定要先搖勻再比較，是因為標準0.5麥氏濁度比濁管中物質易沉淀，不搖勻則配置的菌懸液濃度不正確；

4. 4.??????其他的操作參考DBI-05沙門氏菌生化鑒定試劑盒說明書。

結果判定：需結合說明書上的結果判定表和GB4789.4-2016進行結果判定，具體判定方法參考文章上半部分。

血清學鑒定

血清學鑒定試驗是必做的項目，血清學分型為選做項目可根據各自實驗室的需求選擇。

實驗室應配備沙門氏菌多價菌體（O）和多價鞭毛（H）診斷血清。

1. 1.??????沙門氏菌屬的抗原結構簡介

O抗原：也稱為菌體抗原，是細胞壁的組成成分，Ｏ抗原與抗血清的反應呈顆粒狀；

H抗原：也稱為鞭毛抗原，不同細菌的Ｈ抗原具有特異性，常作為血清學鑒定的依據之一；Ｈ抗原與抗血清的反應呈絮狀或絨狀，大部分沙門氏菌Ｈ抗原都有兩相，第一相被稱為特異性相，第二相為非特異性相；

Vi抗原：是一種特殊的菌體抗原，屬于K抗原群，如傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌和都柏林沙門氏菌都含有Vi抗原。

1. 2.??????培養(yǎng)物自凝性的檢查

在一塊潔凈的玻片上滴加一滴生理鹽水，挑取瓊脂量為1.2%-1.5%的培養(yǎng)基平板上純化的菌株，混合于生理鹽水滴中，混勻，成為均一性的混濁懸液，將玻片輕輕混動30s-60s，置于黑色背景下觀察凝集情況，若出現可見的菌體凝集，則認為有自凝性，說明該菌株發(fā)生S-R變異，失去了O抗原成為粗糙型，不能進行血清學鑒定試驗；反之無自凝性，若無自凝性則繼續(xù)做后續(xù)的血清學試驗。

注意?在做血清學鑒定試驗中，菌株建議使用純化培養(yǎng)18-24h的新鮮菌株；

菌株純化時，建議使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，盡量不用平板計數瓊脂，是因為平板計數瓊脂配方中含有糖類，糖類會干擾血清學的鑒定；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的瓊脂量在1.2%-1.5%之間。

1. 3.??????O多價菌體抗原的鑒定

在潔凈的玻片的一邊滴加一滴生理鹽水作為對照，另一邊滴加一滴O多價血清；

自營養(yǎng)瓊脂平板挑取1環(huán)純化后的待測菌，在生理鹽水滴和多價菌體（O）抗血清滴上方各放1/2環(huán)待測菌，再用無菌的接種環(huán)分別將兩個區(qū)域內的菌苔研磨成乳液狀，將玻片輕輕混動1min，置于黑色背景下觀察，任何程度的凝集現象皆為陽性反應。

注意??研磨菌株時應先研磨生理鹽水區(qū)域，再研磨O多價血清區(qū)域；若先研磨O多價血清區(qū)域，再研磨生理鹽水區(qū)域，有可能會把O多價血清帶入到生理鹽水區(qū)域，造成誤判。

若O多價不凝集時就判定為非沙門氏菌嗎？

此時需要考慮是否因為莢膜的原因而導致的O多價不凝集，分為以下兩步進行排除：

1. I.???????將菌株接種在瓊脂量較高（2%-3%）的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，再進行O多價凝集試驗，這里說的高瓊脂量的培養(yǎng)基，可以在實驗室中，按每100mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（脫水干粉培養(yǎng)基）中加入1g的瓊脂，再高壓滅菌，倒平板備用。

在較高瓊脂量的培養(yǎng)基上再純化的原因：因為菌株在瓊脂量較高的培養(yǎng)基上莢膜發(fā)育不良，可以暴漏出O抗原，有利于檢測是否有菌體抗原存在；

1. II.??????若是因為有Vi抗原存在而阻止O凝集反應時，可多挑取純化后的待測菌株置于1mL生理鹽水中制成濃菌液，煮沸，破壞莢膜的多糖和抗原，暴露O抗原，需要待菌液冷卻后再進行O多價血清的鑒定。

2. 4.??????H多價鞭毛抗原的鑒定

操作與O多價鑒定步驟相同；

但H抗原發(fā)育不良時，H多價血清也會不凝集，此時需要將菌株接種瓊脂量更低（0.55%-0.65%）的半固體瓊脂平板中央，培養(yǎng)后，菌株蔓延生長至平板的邊緣時，取最邊緣的菌株進行H多價血清凝集試驗；

注意?若培養(yǎng)后菌株未蔓延生長，則需要再次轉種半固體瓊脂培養(yǎng)基，直至蔓延生長；

為什么H多價血清鑒定需要瓊脂量更低的半固體瓊脂平板？

因為H多價血清的鑒定需要菌株的鞭毛發(fā)育良好，而培養(yǎng)基的瓊脂量更低時，含有的水分就越多，越有利于菌株鞭毛的發(fā)育和爬行。

促進鞭毛發(fā)育的另一種方法是將菌株通過接種裝有0.3%-0.4%半固體瓊脂的小玻管1-2次，自遠端取菌培養(yǎng)后再檢查，該方法操作較復雜。

結果與報告

綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結果，報告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。

注意??報告結果不能只參考生化試驗或血清學鑒定的結果，而應該綜合考慮生化和血清學兩項的共同結果來判斷。